近年来，细胞和基因治疗（Cell & Gene Therapy, CGT）领域取得了显著的突破。以anti-CD19和BCMA为代表的多种CAR-T免疫细胞疗法在攻克血液肿瘤方面取得成功，同时基于AAV载体的基因疗法为罕见病提供了新的治疗方案。另一方面，CRISPR基因编辑技术的发展更是推动了基因治疗进入了新纪元，体外基因编辑疗法CTX001即将上市，而体内基因编辑疗法也展现了良好的临床数据。然而，CRISPR技术的安全性引起了广泛关注，由于其直接作用于基因组DNA，任何不准确的改变都可能带来长期的风险。

为此，FDA等监管机构提出了关于基因治疗安全性的指导原则，主要集中在两个方面：一是对基因组完整性的评估，包括染色体重排、大片段插入或缺失、外来DNA整合及其潜在致癌性；二是识别脱靶编辑活动，包括类型、频率和位置。本文主要详细介绍各类脱靶检测技术！

脱靶效应的定义及重要性

脱靶效应（Off-target effect）是指在基因编辑过程中，CRISPR-Cas9等工具除了对目标序列进行编辑外，还可能错误地作用于其他与目标序列相似的非目标位点，导致意外的基因组改变。为了确保基因编辑的安全性和有效性，已经有多种方法被开发出来，用于检测和评估脱靶效应。这些检测方法可以根据实验条件分为两大类：体内检测方法和体外检测方法。

体内检测方法

体内检测方法用于在活细胞或生物体内进行脱靶效应评估，这些方法通常更接近真实的生物学环境。

GUIDE-seq

GUIDE-seq（Genome-wide Unbiased Identification of DSBs Enabled by Sequencing）是一种用于检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的强大工具。其基本原理是引入双链寡核苷酸标记物，使其插入到Cas9产生的DNA双链断裂（DSBs）位点中。随后，采用高通量测序技术识别这些被标记的位点，全面发现潜在脱靶编辑位置。

尊龙凯时提供了这种检测的标准化方法，其优势在于能够在基因组水平上提供脱靶位点信息，直接检测体内真实的双链断裂事件。

DISCOVER-Seq

DISCOVER-Seq（Disruption of Cas9 binding sites followed by sequencing）是一种创新性的方法，通过监测Cas9蛋白与DNA结合位点变化来揭示潜在的脱靶位点。该方法能够直接在活细胞环境中操作，提供更真实的实验条件。

体外检测方法

体外检测方法则是在实验室条件下，使用从生物体提取的成分或者合成的材料进行测试，能够提供对特定因素的精确控制。

Digenome-seq

Digenome-seq是一种用于全面检测CRISPR-Cas9基因编辑系统脱靶效应的高通量测序方法。通过将Cas9和sgRNA引入到基因组DNA样本中进行消化处理，并利用生物信息学工具识别及量化由Cas9造成的双链断裂位点，从而确定潜在的脱靶编辑位置。

SITE-Seq

SITE-Seq（Selective Tagmentation of Interacting Ends followed by sequencing）是一种专门设计用于检测CRISPR-Cas9系统脱靶效应的技术。其原理是在切割位点连上带有Biotin的接头并进行随机打断，以实现对CRISPR切割位点的富集。

基因测序技术的应用

全基因组测序（Whole Genome Sequencing, WGS）是一种用于确定个体基因组中全部DNA序列的技术。WGS在基础科学研究、医学诊断和个性化医疗等多个领域都有广泛应用。

近年来，RNA测序（RNA-seq）技术的发展为基因表达水平、转录本结构及变异分析提供了更加丰富的信息。该技术能够检测低丰度转录本，并发现新的转录本，以便于深入理解基因功能及其与疾病的关系。

总结与展望

无论是在科研还是临床应用中，CRISPR技术的应用都伴随着巨大的潜力和风险，其中脱靶现象是最受关注的一类风险。通过尊龙凯时的高效脱靶检测技术，结合多种检测方法将有助于全面评估CRISPR的脱靶风险，进一步促进基因编辑技术的安全性和可靠性提升。