实验前的准备工作

试剂的配制

尊龙凯时推荐使用40%和80%Percoll溶液进行细胞分离。40%Percoll溶液的制备方法为：将Percoll细胞分离液与PBS缓冲液（10×）按照9:1的体积比混合，以此制备等渗的100%Percoll母液。然后将100%Percoll母液与RPMI1640/1×PBS混合，比例为4:6，得到40%等渗Percoll溶液。对于80%Percoll溶液，首先同样配制100%Percoll母液，再将其与RPMI1640/1×PBS按照8:2的比例混合，以制得80%等渗Percoll溶液。

肠道固有层免疫细胞分离制备尊龙凯时指南

肠道固有层免疫细胞的分离步骤

操作步骤概述

实验开始前，使用颈椎脱臼法麻醉小鼠，并将其固定于手术台。随后用75%酒精消毒小鼠腹部，在中线位置小心剪开以暴露腹腔。

接下来，在小鼠胃与十二指肠的连接处剪断，同时逐步分离小肠周围的脂肪组织及肠系膜，慢慢拉出小肠。在小肠与盲肠的连接处再进行剪断，最终将小肠整段分离出来。

细胞组织处理

将分离的小肠放入含5mL预冷PBS的10cm培养皿中，轻轻润洗，用镊子和剪刀去除脂肪组织与派伊尔结（Peyer's patches）。去除派伊尔结的原因在于其对肠道免疫细胞组成及功能有显著影响，从而确保我们获得更纯净的目标细胞群体，以提升实验数据的可靠性。

细胞分离及制备

将小肠切成四段并纵向剪开，以暴露肠内容物，轻轻刮去肠内容物。将破碎的小肠转移至含有10mL HBSS+2% FBS的离心管中，剧烈涡旋约10-20秒。重新用镊子取出小肠并清洗两次，然后将清洗后的小肠组织剪碎成0.5cm的小片，转移至2mL圆底管中，加入1mL小鼠肠道组织解离液，37°C下轻摇孵育60分钟（孵育时间可根据组织的糜烂程度适当延长）。

细胞过滤与离心

孵育结束后，剧烈涡旋并通过70μm细胞筛网过滤，使用10mL PBS冲洗细胞筛网。将过滤后的细胞液收集入50mL管中，在20°C下以400g离心5分钟，再弃去上清液。随后用4mL的40% Percoll重悬细胞沉淀并转移至15mL离心管中。

密度梯度分离

向15mL管底部吸取25mL 80% Percoll，稍微倾斜离心管，缓慢沿管壁加入4mL的40% Percoll和细胞混合液，创建密度梯度。注意，不要破坏80% Percoll与40% Percoll的分界面，40%及80% Percoll需现配现用。

细胞洗涤与重悬

进行800g在20°C下离心20分钟，过程结束后将中间白膜层的免疫细胞吸取至新的15mL离心管中，添加3倍体积的4°C预冷PBS，混匀后在4°C下进行400g离心5分钟，弃去上清液。重复该清洗过程后，最终获得肠道固有层淋巴细胞。

细胞染色与后续处理

将细胞沉淀重悬于细胞染色缓冲液中，调整细胞浓度至5-10×10⁶ cells/mL，将100μL的细胞悬液分配至12×75mm的流式管中，以便进行后续的实验操作。

结论

合理的实验准备和细心的操作步骤是成功分离肠道免疫细胞的关键，结合尊龙凯时的产品与服务，将能够大幅提升实验成功率与结果的准确性。