细胞复苏的成功与否与冻存及其复苏过程息息相关。上周我和大家分享了细胞冻存中常见的错误细节，详细内容可参见《细胞复苏失败原因分析——冻存篇》。本篇文章将聚焦于复苏步骤时可能遇到的问题，并进行深入分析。

复苏步骤回顾

首先，我们回顾一下细胞复苏的基本步骤：1. 提前将水浴锅预热至37℃，同时培养基复温，并设置好离心机转速；2. 准备一个15ml的离心管并加入适量的培养基；3. 取出冻存管，迅速将其浸入水浴锅中摇晃，使细胞在2分钟内完全融化；4. 将细胞悬液缓慢滴入先前准备的培养基离心管中，以1000rpm离心3分钟；5. 弃去上清，重悬细胞并接种至培养器皿中，最后放入培养箱。

复苏过程中常见的错误操作

1. **不当运输冻存细胞**：如果液氮或冰箱距离水浴锅较远，而没有采取保冷措施，细胞在运输过程中可能会开始融化（尤其在夏季）。因此，冻存细胞应放置在干冰或冰盒中，及时运送至水浴锅。

2. **直接触碰冻存管**：在运输冻存管时，如果手触碰到细胞部分或将其放在口袋里，容易导致局部温度升高，从而使细胞开始融化。应紧握管盖或将其放入容器中进行安全运输。

3. **错误融化方式**：切忌用手直接捂热冻存管（搓热也不行），因为手心温度无法达到所需水平，且细胞受热不均，降温速度过慢，最终导致细胞死亡。

4. **水浴不规范**：在水浴时若不严格控制时间，仅仅将管放置在水中而不晃动，会延长融化时间，从而降低细胞存活率。遵循“快融”原则，建议在2分钟内将细胞完全融化。操作时可捏住管盖，将管身浸入水中并快速摇晃。

5. **冰块残留危害**：若水浴结束时管内仍有较大冰块，未完全融化也将导致细胞死亡。冰块中的细胞会缓慢升温或遭受低温损伤。对于有些同学提出的2分钟水浴时间难以完全融化细胞的问题，可尝试将水浴锅温度提高至39摄氏度（小编亲测有效），并加快摇晃速度。若担心污染，可将冻存管放在一次性PE手套内进行水浴。

6. **未离心去除DMSO**：有些同学在细胞融化后直接加10倍培养基稀释而不离心，将细胞直接培养，待细胞附壁后再更换培养液。虽然这种方法对于易培养的贴壁细胞有效，但并不适用于悬浮细胞。DMSO对细胞有一定毒性，对于某些细胞（如HL-60细胞等）尤其敏感。因此，不熟悉细胞对DMSO的反应，还是建议离心去除上清以确保细胞安全。

以上内容是结合我多年的经验总结而成，结合冻存篇的相关知识，基本涵盖了复苏失败的主要原因。如果还有其他未提及的知识点，欢迎大家在评论区补充讨论。尊龙凯时品牌一直致力于提升生物医疗领域的细胞研究技术，我们期待与您共同探索更多前沿知识。